馮波，翁杰，屈樹新
（西南交通大學材料科學與工程學院，四川成都610031）
Surface biological modification for bone substitute materials: a review
FENG Bo, WENG Jie, QU Shu-xin
(School of Materials Science and Engineering, Southwest Jiaotong University, Chengdu 610031, China)
Abstract：This paper reviews the current trend of surface biological modification for bone substitute implants. Section 1. gives an introduction. Section 2. presents that biological molecules, proteins and growth factors adsorb or bond onto surfaces of materials. Section 3. includes application of self-assembly monolayers and micropattern in surface modification of biomaterials.
Key words：bone substitute materials；biological modification；natural organic molecule；protein；self-assembly；micropattern
摘要：評述了近年對骨植入材料進行表面生物化改性的研究進展。第一部分是簡要的概述。第二部分涉及通過物理吸附或化學作用使黏附性蛋白、生物活性肽、生長因子和某些生物分子等結合到骨生物材料表面，以及這些蛋白質與鈣磷共同結合到材料表面。第三部分綜述了自組裝單層（SAMs）和微模型化（Micropattern）技術在骨生物材料表面改性方面的研究現(xiàn)狀。
關鍵詞：骨替換材料；生物化改性；天然有機分子；蛋白質；自組裝；微模型化
中圖分類號：TQ174;TB33 文獻標識碼：A
文章編號：1001-9731（2004）增刊-2321-04
1 引言
骨生物材料主要包括關節(jié)替換材料和牙種植材料。理想的骨替換材料應當具備優(yōu)良的生物活性和適宜的機械性能，以便與骨組織形成化學鍵合。并且有足夠的負載能力、耐磨損和耐腐蝕等性能。負荷承載能力與材料的體性能和植入器械的結構設計等有關。生物活性、耐磨損和耐腐蝕能力則主要取決于材料的表面性能。然而，通常的生物材料很難同時兼具良好的體性能和表面性能。如金屬材料雖承載能力強，但通常呈生物惰性，難以與骨組織形成化學鍵合，也不能避免磨損和腐蝕的問題。盡管一些生物陶瓷，如羥基磷灰石(HA)、生物玻璃陶瓷和硅灰石等具有優(yōu)異的生物活性，但存在脆性大和耐磨性差的缺陷。高分子材料有著金屬和陶瓷不可比擬的柔韌性，然而往往不具備生物活性，且易磨損。因此，除通過多種成分結合，制備性能互補的復合材料外，利用表面技術改善材料表面生物學性能成為當今骨生物材料研制的一個重要發(fā)展方向。
對于骨生物材料的表面改性，主要目的之一是改善植入材料與骨組織形成化學鍵合的能力。這種鍵合使材料與組織產生牢固的骨性結合（Bone-bonding），而不是被纖維組織所分隔。通常認為，界面類骨羥基磷灰石（Bone-like hydroxyapatite，BLHA）的形成是骨鍵合的必要條件，因為BLHA能夠吸附骨生長因子等蛋白質，引導骨細胞在其表面生長，促進骨組織的修復與重建。迄今在通過表面活化改性，使材料表面具有形成BLHA的能力方面，已經提出多種方法，做了大量研究。而另一方面，由于生物材料植入體內后，首先是蛋白質吸附到表面，與材料表面相互作用。隨后，已受到蛋白質調制的表面再與細胞作用，發(fā)生細胞黏附，分化與生長。因此，通過生物化學改性，在材料表面引入能促進骨生長的蛋白質或某些生物分子成為表面生物活化改性的另一途徑。近年開始受到關注。有時也涉及將生物有機成分與生物無機成分，如Ca和P等同時結合到材料表面。總之，骨生物材料的表面改性就是要在材料表面構建骨組織的生理或仿生微環(huán)境。2 吸附與共價結合[1~10]
與骨生長相關的蛋白質主要有黏附性蛋白、生物活性肽和生長因子等幾類。黏附性蛋白包括膠原、纖維粘連蛋白（Fibronectin，F(xiàn)N）、玻璃粘連蛋白（Vitronectin，VN）和層粘連蛋白（Laminin，LN），生長因子包括骨形成蛋白（Bone morphogenetic protein, BMP）和轉移生長因子（Transforming growth factor），生物活性肽包括精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列（Arginine-glycine-aspartic acid, RGD）這一許多細胞外基質蛋白(如VN、FN和膠原等)的最小識別順序，以及賴氨酸–精氨酸–絲氨酸–精氨酸（Lysine-arginine- serine-arginine，KRSR）。可利用化學或生物化學手段將這些生物分子或酶等固定到材料表面或在表面制作蛋白質涂層，使骨生物材料表面活性化。
雖然磷酸鈣陶瓷，尤其是HA具有優(yōu)良的生物活性，但是，合成HA與骨組織中天然HA仍然存在明顯差異。一方面，合成HA通常不含Mg、K、F和CO32− 等無機成分；另一方面，骨骼中HA是與膠原和蛋白質等有機成分有序組合排列。此外，在體內，合成HA 表面層轉化為BLHA往往需要較長的誘導期。因此為了進一步改善生物活性，有時也對磷酸鈣陶瓷進行表面改性。白蛋白是體液中一種含量豐富的蛋白質，易于與多肽共價結合，從而促進細胞在植入材料表面的吸附與生長。血清白蛋白能化學吸附到HA表面，形成血清白蛋白-HA復合物，改變了Ca/P比例。富含酸性氨基酸，如谷氨酸（Glutamic acid）的仿生肽谷氨酸-脯氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-蘇氨酸（Glutamic acid-Prolin-arginine-glycine-aspartic acid –threonine）通過其羥基與HA中的鈣結合，化學吸附到羥基磷灰石表面，能夠促進成骨細胞的附著與擴展。用三羥甲基氨基甲烷電解緩沖液進行磷酸鈣表面層修飾，并吸附血清蛋白后，能明顯促進造骨細胞的吸附與分化。
對于鈦的表面活化改性，當添加BSA到過飽和鈣磷溶液中，BSA對HA層的形成有一定抑制作用，但是BSA能與Ca-P共沉積到鈦表面。并且，BSA能結合到HA晶格中，而不是吸附在表面。同時，還能促進磷酸鈣的晶型轉變，如使磷酸八鈣轉化為HA。對于涂層的機械強度也有改善。如劃痕試驗表明，當BSA濃度在10~1.0mg/ml范圍時，涂層機械強度隨濃度線性增加。
FN和VN是多糖蛋白，具有黏附細胞，包括成骨細胞的能力，對骨形成有著重要作用。Kothari等將VN固定到鈦表面,利用Westernblotting 法測多克隆抗體數(shù)量，包括FN和纖維蛋白原，以白蛋白Ab為對照。發(fā)現(xiàn)固定有VN的骨結合界面上存在更多的蛋白。而且，由于整合素(Integrin)中VN的受體αv和β3與成骨細胞間的相互識別，促進了成骨細胞附著和骨基質粘附與生長。但是，當用Hanks平衡鹽溶液（HBSS）活化處理鈦時，無論是表面預涂FN后再浸入HBSS，還是浸入FN+HBSS，均發(fā)現(xiàn)FN對Ca-P層的形成有一定抑制作用。而且，當FN濃度增加到0.05mg/ml，盡管還遠低于生理溶液中的濃度，如血液中為0.2mg/ml，就已經顯示出較強的抑制作用。I 型膠原是骨中的主要有機成分，以I 型膠原涂覆鈦后，大幅度地提高了角質形成細胞和成骨細胞的附著能力，尤其是對于細胞的初期黏附。LN也是參與骨形成的一種蛋白質。鈦表面涂覆LN后，明顯改善了角質細胞形成和膠原礦化用。
表面有RGD肽涂層時，增強了成骨細胞的附著能力。體內試驗也表明以肽序列改性鈦后，促進了新骨生長。在鈦表面沉積與肽有強附著力的金后，浸泡于精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-半光氨酸（RGDC）肽的乙醇和水溶液，室溫過夜使肽吸附到材料表面。植入兔股骨2周后，發(fā)現(xiàn)有肽涂層的試樣周圍，新骨厚度更大，4周后新骨明顯增多，而無肽試樣幾乎沒有變化。前者的拔出強度亦高于后者。用溶膠－凝膠法在鈦表面制備氨基酸涂層則不需加入中間層。以堿溶液預處理鈦后，用賴氨酸和四乙氧基鈦溶于乙醇溶液制成溶膠，利用浸涂方法就可得到含氨基酸的涂層。
BMP序列中，人基因重組產物BMP-2，BMP-4，rhBMP-2，rhBMP-4具有優(yōu)良的生物活性，能夠促進體內新骨在原位和異位生長。Puleoa 等用體外試驗研究了表面含BMP-4的Ti6Al4V對成骨細胞活性的影響。通過賴氨酸的等離子體聚合，在Ti6Al4V表面引入氨基，將氨基量控制在5～12NH2/nm2之間。然后用以固定溶霉菌和BMP-4。以簡單吸附作為對照。固定程序分為兩種，一步法是直接將氨化的鈦浸泡于蛋白質溶液，兩步法是用丁二酸酐將氨基轉化為羧基后，再置于蛋白質溶液中。這兩種固定程序都能控制蛋白質的結合量，但是一步法引起的交聯(lián)使溶霉菌失去活性。用鼠成骨細胞株培養(yǎng)試驗表明，簡單吸附和兩步法固定BMP-4試樣均顯示出較高堿性磷酸酶活性，前者還高于后者。如果當細胞培養(yǎng)前在生理溶液中預孵化，以除去弱吸附的蛋白質后，再進行細胞培養(yǎng)，雖然兩者的堿性磷酸酶活性都有降低，但是，固定BMP-4的鈦試樣較吸附試樣有更高堿性磷酸酶活性。說明化學固定蛋白質對于鈦表面改性有更好的活化效果。在筒狀鈦絲網(wǎng)植入體表面吸附以聚乳酸-聚乙烯乙二醇共聚物為載體的rhBMP-2后，植入兔肱骨上預留的缺損部位。6周以后植入體表面新骨生成，并與斷骨連接。新骨也長入植入體的空隙中。缺損被修復的程度與植入體表面rhBMP-2含量有關。
磷是HA中的一個重要成分，并且二磷脂類化合物對骨羥基磷灰石有高親合性，具有防止成骨細胞吸收及骨吸收的功能。因此，以含磷化合物改性鈦表面也是一個有效途徑。但是簡單地用磷酸浸泡處理，雖然鈦表面的復合磷化物和表面羥基及微孔結構也能使鈦表面在一定程度上生物活性化，誘導HA在鈦表面自發(fā)生長。但是其效果遠較Ca(OH)2 預處理法為差。已經發(fā)現(xiàn)天然磷脂類（PL）與鈣磷的復合物PL-Ca-P復合物具有誘導磷酸鈣沉積的作用。Arpan Satsangia 等以磷脂酰膽堿（Phosphatidycholine）、磷脂酰肌醇（Pphosphatidyl-serine, PS）和磷脂酰絲氨酸（Phosphatidylinositol）涂覆于鈦表面，再與Ca-P溶液作用，形成Ca- PL –P復合物表面層。成骨細胞培養(yǎng)試驗顯示，Ca-PS –P/Ti 表面蛋白質合成量和細胞的堿性磷酸酶活性高于未改性鈦，并且置于SBF浸泡后，Ca-PS–P/Ti表面礦化層最為明顯，而未改性鈦表面沒有礦化發(fā)生。這表明用Ca-PS –P對鈦表面改性可能有助于鈦表面的骨生長。
3 自組裝和微模型化[11~24]
自組裝（SAMs）是自然界的重要現(xiàn)象，通過自組裝形成各種高度有序、具有特定功能的結構。如核酸中的基因信息儲存、太陽能轉化為生物化學能、蛋白質組織為有效的分子機構、HA與膠原等自組裝為骨組織等。20世紀80年代后期，Whitesides 和Porter等報道了長鏈烷基硫醇（HS(CH2)n, n ≥ 10, X = 功能基）能從溶液中吸附到金表面，形成密集排列，并有序取向的單層，即自組裝單層（Self-assembled monolayers）。硫強烈地吸附到金表面。X端基位于液-單層界面。在生物醫(yī)學工程中，SAMs 技術被用于研究生物系統(tǒng)內信息的儲存、復制與傳遞等，研制生物傳感器和藥物緩釋系統(tǒng)等。在骨生物材料方面，SAMs作為一種模型系統(tǒng)，在材料表面建立一些特殊位點，既可用于研究細胞或蛋白質在這種模板化表面的行為，及其與特殊位點的成分、性能和結構等的關系，也用作誘導HA形成的生物模板。
表面微模型化（Micropattern）技術近年正在成為研究細胞-材料界面作用和活化改性骨生物材料的新方法。使材料表面化學物質微模型化，固定對骨生長具有活性的蛋白質或肽，促進和引導特定的細胞附著到材料表面，以增強細胞與材料表面的相互作用。為了避免某些非特異性細胞黏附到表面。也可以印制阻礙該細胞黏附的蛋白質或肽。簡單的微模型化技術有微書寫（Micro-writing）、微加工（Micro-process）和微印制（Micro-imprint）等。其中，微印制技術也稱為微接觸印制（Micro-contact print），以其簡單和低成本而顯示出很好的應用前景。微印制技術的一般程序是：先以樹脂（如甲基丙烯酸甲酯，PMMA）溶液涂覆到某種基材上，固化后用光刻技術（Photolithographic）或其他方法刻蝕樹脂，得到含有需復制花樣（Pattern）的掩模（Mask）；然后將另一種樹脂覆蓋到掩模上并固化；分離樹脂與掩模，得到與掩模陰陽相反的模板，即印章（Stamp）；在印章表面涂覆蛋白質溶液或SAMs的成膜溶液，將溶液印制到另一底材上，按印章花樣在不同區(qū)域形成蛋白質層或SAMs；無蛋白質層或SAMs的區(qū)域可再通過吸附或化學反應制備其他膜。這樣就按印章得到模型化的蛋白質層或SAMs，也稱為模板。各區(qū)域的大小、化學成分和分子結構等都對蛋白質和細胞與表面的作用有影響。
M.E. Hasenbeina等用微接觸印制方法研究了表面不同大小的圓形區(qū)域及在其上固定的肽對成骨細胞附著的影響。首先用光刻法制備印章，使印章表面分布著多個由親水化合物3-三乙氧基硅丙基-二乙烯三胺(3-(trimethoxysilyl)propyl)-diethylenetriamine，DETA) 覆蓋的圓形區(qū)域，不同印章表面圓形區(qū)域的直徑分別為10、50、100或200µm。各圓形之間的間隔均為10µm，被憎水化合物八癸烷三氯硅烷（Octadecyltrichlorosilane(OTS)）所覆蓋。再用微接觸印制技術將印章上的花樣轉印到蓋玻片上。DETA區(qū)域進一步以不同的肽（如精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-絲氨酸（Arginine-glycine-aspartic acid-serine，RGDS）； 精氨酸-天冬氨酸-甘氨酸-絲氨酸（Arginine- aspartic acid-glycine-serine，RDGS）；賴氨酸-絲氨酸-絲氨酸-精氨酸（Lysine-serin-serine- arginine，KSSR）或KRSR）進行表面改性。然后作成骨細胞和成纖維細胞培養(yǎng)試驗。4h之后，在含有非黏附肽RDGS和KSSR的圓形區(qū)，成骨細胞或成纖維細胞極少附著，隨機分布。而在黏附性肽RGDS改性的圓形區(qū)，成骨細胞和成纖維細胞均附著并成族狀。另一種黏附性肽KRSR具有選擇性促進成骨細胞附著的能力，在KRSR改性的圓形區(qū)，僅成骨細胞附著，形成族狀。這說明某些肽的模型化區(qū)域能夠引導特定的細胞株附著。如在微模型化表面，固定有KRSR的區(qū)域能擇優(yōu)黏附成骨細胞，而不是成纖維細胞。模型尺寸對細胞黏附有影響，如圓形小于成骨細胞尺寸時，不宜于成骨細胞黏附。在用光刻法制得的印章表面傾倒角質蛋白溶液，待充分反應后，除區(qū)未組裝的角質蛋白，可得到含自組裝角質蛋白網(wǎng)絡的印章。角質蛋白是牙骨中細胞外基質蛋白，對牙種植體表面的骨生長有促進作用。
4 結語
生物化學表面改性思想是以人體組織中的生物分子與植入材料的相互作用為基礎，為骨生物材料的表面活化研究提出了一個新方向，也初步獲得了一些有益的啟示。但是在生理環(huán)境，尤其是骨組織環(huán)境，并不是僅僅存在有機分子，而常是有機成分與無機成分以特定方式結合共存。因此，在骨生物材料表面構建極為接近天然狀態(tài)的結構，始終是研究者的努力方向，目前，這一距離正在縮短。
參考文獻：
[1] Ghannam-AEl, Ducheyne P, Shapiro I M. [J]. J Orthop Res, 1999, 17:340-345.
[2] Liu Y, Hunziker E B, Randall N X, K de Groot, Layrolle P. [J]. Biomaterials, 2003, (24): 65–70.
[3] Wen H B, J R de Wijn, CA van Blitterwijk, K de Groot. [J]. J Biomed Mater Res, 1999, (46): 245-252.
[4] Horton M. [J]. Bone, 1995,17(2):51-53.
[5] Paul A, Serro V A do, A Catarino C Fernandes, B de J V Saramago. [J]. J Biomed Mater Res, 2000, (49):345-352.
[6] Ferris D M, Moodie G D, Dimond P M, Gioranni C W D， Ehrlich M G, Valentini R F. [J]. Biomaterials, 1999,20: 2323-2331.
[7] Vogel E, Meuer P, Kiefer W, Urlaub R, Thull R. [J]. J Mol Struct, 1999,482–483:241–244.
[8] Puleo D A, Kissling R A, Sheu M-S. [J]. Bioma- terials, 2002,23:2079–2087.
[9] Murakami N, Saito N, Horiuchi H, Okada T, Nozaki K, Takaoka K. [J]. J Biomed Mater Res, 2002, 62: 169–174.
[10] Satsangia A, Satsangia N, Glovera R, Satsangib R K, Ong J L. [J]. Biomaterials, 2003,24: 4585–4589.
[11] Bain C D, Evall J, Whitesides G M. [J]. J Am Chem Soc, 1989,111:7155–7164.
[12] Porter M D, Bright T B, Allara D L, Chidsey C E D. [J]. J Am Chem Soc, 1987,109: 3559– 3568.
[13] Kane R S, Takayama S, Ostuni E, Ingber D E, Whitesides G M.[J]. Biomaterials, 1999, 20:2363-2376.
[14] Bunker B C, Rieke P C, Tarasevich B J, Campbell A A, Fryxell G E, Graff G L, Song L, Liu J, Virden J W, McVay G L. [J]. Science. 1994, 264: 48-55.
[15] Massia S P, Stark J, Letbetter D S. [J]. Biomaterials, 2000,21: 2253-2261.
[16] Liu Q, Ding J, Mante F K, Wunder S L, George R. Barana. [J]. Biomaterials, 2002, 23:3103-3111.
[17] Tanahashi M, Matsuda T. [J]. Journal of Biomed Mater Res, 1997,34 :305–315.
[18] Scotchford C A, Cooper E, Leggett G J, Downes S. [J]. J Biomed Mater Res, 1998,41: 431–442.,.
[19] Martins M C L, Fonseca C, Barbosa M A, Ratner B D. [J]. Biomaterials, 2003,24:3697–3706.
[20] Campbell A A, Song L, Li X S, Nelson B J, Bottoni C, Brooks D E, DeJong E S. [J]. J Biomed Mater Res (Appl Biomater). 2000, 53: 400–407.
[21] Hasenbeina M E, Andersenb T T, Bizios R. [J]. Biomaterials. 2002, 23: 3937–3942.
[22] Winkelmann M, Gold J, Hauert R, Kasemo B, Spencer N D, Brunette D M, Textor M. [J]. Biomaterials, 2003, 24:1133- 1145.
[23] Scotchford C A, Ball M, Winkelmann M, Voros J, Csucs C, Brunette D M, Danuser G, Textor M. [J]. Bioma- terials, 2003, 24: 1147–1158.
[24] Sgarbi N, Pisignano D, Benedetto F Di, Gigli G, Cingolani R, Rinaldi R. [J]. Biomaterials, 2004, 25:
1349–1353.
基金項目：國家自然科學基金資助項目（30370408）
作者簡介：馮波(1957－)，男，四川南充人，博士，教授，西南交通大學材料科學與工程學院。研究領域為生物醫(yī)用材料。（E-mail:fengbh@163.com; Tel:028-87634023）
論文來源：中國功能材料及其應用學術會議,2004年,9月12-16日
