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程忠玲1,2，王松1，朱鶴孫1
(1. 北京理工大學(xué)材料科學(xué)研究中心，北京100081；2. 承德石油高等?？茖W(xué)?；は?，河北承德067000)
Preparation and blood anticoagulant activity of heparinized collagen/silk fibroin blend film
CHENG Zhong-ling1,2, WANG Song1，ZHU He-sun1
(1. Research Center of Material Science, Beijing Institute of Technology, Beijing 100081, China;
2. Department of Chemical Engineering, Chengde Petroleum College, Chengde 067000, china)

Abstract：The blend film was prepared by blending the heparinized collagen and aqueous of silk fibroin, and glutaraldehyde was used as a coupling agent in order to enhance its mechanical properties of blend film. The blend film in vitro blood anticogulant activity was assessed by activated partial thromboplastin time (APTT), activated thromboplastin time (PT), thrombin time (TT) measurement. The combination rate approached the optimum of 56% and the rupture strength was 45MPa as glutaraldehyde mass concentration was 5g/L.Experiments were done to determine APTT, TT, PT. APTT, TT, PT of blend film was excess 150, 200 and 50s respectively.
Key words：collagen；silk fibroin；heparinize；anticoagulant activity
摘要：將肝素化膠原與絲素溶液共混，制備了肝素化膠原/絲素共混膜，并采用戊二醛作為交聯(lián)劑，以提高共混膜的機(jī)械性能。共混物的體外抗凝血活性采用部分凝血活酶時(shí)間(APTT)、凝血活酶時(shí)間(PT)、凝血酶時(shí)間(TT)來(lái)評(píng)價(jià)。當(dāng)戊二醛的質(zhì)量濃度為5g/L時(shí)，肝素的結(jié)合率為56%，共混膜的斷裂強(qiáng)度為45MPa。APTT、TT、PT凝血時(shí)間實(shí)驗(yàn)證明，共混膜的APTT、TT、PT分別超過(guò)150、200和50s。
關(guān)鍵詞：膠原；絲素；肝素化；抗凝血性
中圖分類號(hào)：O636.9         文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A
文章編號(hào)：1001-9731（2004）增刊-2484-03

1 引言
         利用肝素化來(lái)提高材料的抗凝血性研究始于20世紀(jì)60年代。最先通過(guò)離子鍵使材料表面肝素化的途徑是Gott提出的GBH方法,而近年來(lái)采用離子鍵固定肝素主要是利用大分子主鏈或側(cè)鏈季胺化再肝素化的方法。本文選用酶法制備的膠原作為固定肝素的載體，是因?yàn)槟z原是一種天然生物材料，生物相容性好，在酸性條件下膠原中帶正電的氨基基團(tuán)可與肝素中帶負(fù)電的硫酸基團(tuán)相互作用，以離子鍵結(jié)合形成肝素化膠原復(fù)合物[1]。為解決酶法制備的膠原存在機(jī)械性能差，溶漲性大的弱點(diǎn)，在肝素化膠原中加入另一種成膜性較好的天然纖維蛋白質(zhì)——絲素蛋白，以解決肝素化膠原的溶漲問(wèn)題，并加入戊二醛（GA）為共混膜的交聯(lián)劑，GA可與蛋白質(zhì)形成交聯(lián)結(jié)構(gòu)，蛋白質(zhì)之間通過(guò)穩(wěn)定的碳氮共價(jià)鍵的搭橋而緊密結(jié)合在一起，其穩(wěn)定性和力學(xué)性能大大提高[2]。體外抗凝血實(shí)驗(yàn)APTT、TT、PT表明，該共混膜具有良好的抗凝血性能，從而得到一種性能優(yōu)良的新型生物醫(yī)用復(fù)合膜。
2 實(shí)驗(yàn)
2.1 絲素蛋白溶液的制備
         蠶絲用0.5%NaCO3水溶液煮沸30min,精練2次，精煉后用蒸餾水充分洗凈，自然干燥得到脫膠絲素纖維。然后用氯化鈣∶乙醇∶水=1∶2∶8（摩爾比）的溶劑在80℃下溶解絲素纖維。將溶解得到的絲素溶液倒入纖維素透析膜中，分別在水、蒸餾水中透析72 h，濾去雜質(zhì)，得絲素水溶液。用紫外吸收法測(cè)定濃度。
2.2 肝素化膠原的制備
         豬皮在0.5g/L的NaOH溶液中浸泡過(guò)夜，脫脂后在pH=3條件下，用適量的胃蛋白酶和青霉素酶解4d，當(dāng)降解物成膠狀后，用0.5g/L的NaOH溶液調(diào)至pH=10，并放置于4℃冰箱中使胃蛋白酶失活。然后采用等電點(diǎn)沉淀法調(diào)節(jié)pH=6~7使膠原沉淀，冷凍離心分離、純化，然后在0.1g/L的醋酸溶液和蒸餾水中分別透析3d，冷凍干燥得膠原。將50mg膠原在0.2g/L的醋酸溶液5mL中于50℃溶解后，向其內(nèi)滴加10g/L的肝素溶液0.5mL，均勻攪拌10min,得到肝素化膠原。結(jié)構(gòu)表征采用EQINOX55型紅外光譜儀進(jìn)行紅外掃描。
2.3 肝素化膠原/絲素共混膜的制備
         將肝素化膠原與絲素溶液共混（膠原/絲素的質(zhì)量比為1/4），加入戊二醛作交聯(lián)劑，混合并緩慢攪拌，靜置脫泡，注入聚乙烯模具內(nèi)，在25℃、相對(duì)濕度為65%的環(huán)境下干燥72h成膜。
2.4 肝素結(jié)合率的測(cè)定[3]
2.4.1 肝素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
         將25mg甲苯胺藍(lán)溶于500ml含有0.49ml的37%HCl和1g NaCl的去離子水中，得到0.05g/L的甲苯胺藍(lán)溶液。用進(jìn)樣器量取3ml已知濃度的肝素水溶液于試管中，加入3ml甲苯胺藍(lán)溶液，充分振蕩混勻，然后加入3ml正己烷后振蕩混合使其分相，讀取下層水相在631nm處的吸光度，以肝素含量（μg）為x軸，631nm吸光度為y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
2.4.2 肝素結(jié)合率的測(cè)定
         將肝素化的共混膜浸入15ml水中，5天測(cè)試一次浸泡液中肝素的溶出量，方法為量取3ml已定容的浸泡液于試管中，其它試劑的加入同1.5.1方法，測(cè)其吸光度，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線，讀出相應(yīng)肝素的量，直至浸泡液中的肝素溶出量為零。按結(jié)合在共混膜中的肝素量來(lái)計(jì)算肝素結(jié)合率。
2.5 膜的機(jī)械性能測(cè)定
         將膜裁成10mm×60mm的樣條，用TOM500J型萬(wàn)能引張壓縮機(jī)測(cè)定膜的拉伸強(qiáng)度,拉伸速度100mm/min,負(fù)載5㎏，每組3個(gè)樣品，取其平均值。
2.6 體外抗凝血活性評(píng)價(jià)
         體外抗凝血活性評(píng)價(jià)，采用體外凝血時(shí)間試驗(yàn)，包括APTT、TT、PT 3種凝血時(shí)間測(cè)定。將試樣置于比色杯中，在健康人血漿中溫育一定時(shí)間，加入測(cè)定APTT、TT、PT所需的各種酶反應(yīng)試劑，引發(fā)血栓的形成。APTT、TT、PT3種凝血時(shí)間測(cè)定采用COAG-A-MATE-XM型半自動(dòng)四通道凝血儀，按使用說(shuō)明測(cè)定。
3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析
3.1 肝素化膠原/的形成
         膠原是由三股α-肽鏈相互擰成的纖維狀蛋白質(zhì)，膠原蛋白分子是由多肽鏈作螺狀纏繞而成的繩索狀大分子，每條多肽鏈約含1030個(gè)氨基酸殘基，由于氨基酸中含有酸性的羧基和堿性的氨基,羧基可以把質(zhì)子轉(zhuǎn)移到堿性的氨基上，在同一分子上產(chǎn)生一個(gè)正電荷和一個(gè)負(fù)電荷，使氨基酸成為偶極離子，常常以兩性離子的形式（－NH3+ 和COO - ）存在[4]。肝素（a）、復(fù)合物（b）、膠原（c）的紅外光譜見(jiàn)圖1。從復(fù)合物的紅外光譜圖1（b）中可以看出，1652（酰胺I）、1538（酰胺II）、1240（酰胺III）和565cm-1（酰胺V）是膠原相應(yīng)酰胺的特征峰，在850cm-1處出現(xiàn)新峰，為復(fù)合物的硫酸基團(tuán)C－O－S伸縮振動(dòng)峰，由于肝素的硫酸基與膠原中帶正電氨基形成了離子鍵，使其從820 cm-1（肝素的硫酸基位置）移到了850 cm-1。
3.2 肝素的結(jié)合率
3.2.1 肝素的標(biāo)準(zhǔn)曲線
         采用甲苯胺藍(lán)染色法測(cè)定肝素的含量。肝素可以與甲苯胺藍(lán)形成復(fù)合物而使溶液中甲苯胺藍(lán)含量有所下降，加入非極性有機(jī)溶劑如正己烷進(jìn)行抽提，將肝素-甲苯胺藍(lán)復(fù)合物抽提到有機(jī)相中。通過(guò)檢測(cè)溶液在一定波長(zhǎng)（甲苯胺藍(lán)的特征吸收波長(zhǎng)通常為631nm）處吸光度的下降便可求得所測(cè)肝素量。圖2為肝素在631nm處的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

3.2.2 戊二醛質(zhì)量濃度對(duì)共混膜的肝素結(jié)合率的影響
         戊二醛質(zhì)量濃度對(duì)共混膜的肝素結(jié)合率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。未用戊二醛交聯(lián)的肝素化膠原/絲素共混膜的肝素結(jié)合率為32%，加入戊二醛后，肝素結(jié)合率隨戊二醛的質(zhì)量濃度增加而增加，當(dāng)戊二醛的質(zhì)量濃度增加到5g/L時(shí)，肝素結(jié)合率達(dá)到56%，以后隨著戊二醛用量的進(jìn)一步增加，稍微出現(xiàn)下降的趨勢(shì)。

         正常人血的凝血時(shí)間分別為：PT：(11±3)s；APTT：(28±10)s；TT：(16±5)s。表2數(shù)據(jù)表明，所采集的血漿樣品的凝血時(shí)間在正常范圍之內(nèi)。通過(guò)測(cè)定膠原/絲素膜與血漿接觸后的凝血時(shí)間可以看出，未經(jīng)肝素化處理的絲素/膠原膜的凝血時(shí)間與空白血漿的凝血時(shí)間相比變化不大。而經(jīng)肝素化后的膠原/絲素膜表現(xiàn)出優(yōu)異的抗凝血性能，3種凝血時(shí)間APTT、TT、PT都超出了儀器的設(shè)定范圍，表明固定在膠原/絲素膜中的肝素仍保持良好的生物活性，有效地提高材料的抗凝血性。
4 結(jié)論
         將肝素化膠原與絲素共混，以戊二醛為交聯(lián)劑，制備的共混膜中肝素的結(jié)合率及其機(jī)械強(qiáng)度與交聯(lián)劑的質(zhì)量濃度有關(guān)，當(dāng)戊二醛的質(zhì)量濃度為5g/L時(shí)，共混膜的肝素結(jié)合率為56%，斷裂強(qiáng)度為45MPa，凝血時(shí)間APTT、TT、PT分別超過(guò)150、200和50s。

參考文獻(xiàn)：
[1] 朱鶴孫. 醫(yī)用與口腔材料. [M]. 北京: 科學(xué)出版社, 1999, 5.
[2] 李天全. [J]. 生物醫(yī)學(xué)工程雜志, 1998, 5(2): 118-124.
[3] Ducan AC, Boughner D, Campbell G. [J]. European Polymer Journal, 2001, 37: 1821-1826.
[4] 胡建芳, 錢露西, 郭淑靜, 等. [J].材料研究學(xué)報(bào), 1994, 8(1): 82-87.

基金項(xiàng)目：國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究（973）計(jì)劃項(xiàng)目（G1999064705）
作者簡(jiǎn)介：程忠玲（1969—），女，山東榮成人，講師，承德石油高等?？茖W(xué)校教師，主要從事抗凝血材料的研究。（E-mail: czl1969.student@sina.com），Tel: 010-68949661。

論文來(lái)源：中國(guó)功能材料及其應(yīng)用學(xué)術(shù)會(huì)議,2004年,9月12-16日