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  3D打印技術能夠構建精準化和個性化的骨再生修復支架。海藻酸鈉(SA)是一種被廣泛用于3D打印制造組織工程支架的海洋多糖材料，它有著來源廣泛、價格低廉、生物相容性好，凝膠化速度快且易于3D構建等優(yōu)點。但是，單組分的SA機械性能較差，SA支架容易坍塌不易成型，這限制了它在骨缺損修復支架的應用。埃洛石納米管(HNTs)是高嶺土族的粘土礦物，也是一種天然的一維納米材料，因為具有獨特的中空管狀結(jié)構、高的長徑比、來源廣和價格低等優(yōu)點，是許多高分子的納米增強填料。通過物理共混法將SA和HNTs結(jié)合，用3D打印技術制備出高性能的骨缺損修復支架具有光明的應用前景。

  近日，暨南大學化學與材料學院劉明賢教授團隊與廣東醫(yī)科大學附屬醫(yī)院趙名艷老師合作，將SA與HNTs通過物理混合得到生物墨水，并用3D打印技術及高溫燒結(jié)的加工方法制備出具有良好的成形性、生物相容性和成骨活性的SA/HNTs骨修復陶瓷支架。該研究成果以“Three-dimensional Printed Sodium Alginate Clay Nanotube Composite Scaffold for Bone Regeneration”為題發(fā)表在Composites Science and Technology（影響因子9.1，一區(qū)TOP）期刊上。暨南大學化學與材料學院研究生周友全、廣東醫(yī)科大學附屬醫(yī)院高翔助理研究員為該論文共同第一作者，廣東醫(yī)科大學附屬醫(yī)院趙名艷副研究員、暨南大學劉明賢教授為共同通訊作者。

  本工作采用實驗室自行改裝的商業(yè)3D打印機。如圖1a所示，SA和HNT混合得到SA/HNT油墨。將設計好的模型用3D打印機打印完成后，用CaCl₂將其轉(zhuǎn)化為水凝膠，得到SA/HNTs水凝膠。最后，對水凝膠進行高溫燒結(jié)，得到SA/HNTs陶瓷。合適的粘度是墨水可打印性和成型性的關鍵。圖1b中，當SA的濃度增加，SA/HNTs的復合材料逐漸從液體轉(zhuǎn)變?yōu)榭沙尚托�，但是當SA的濃度增加到8%時，墨水出現(xiàn)干皺的情況。另外，如圖1c和圖1d所示，為了保證墨水能從微小的針頭順利擠出，評測了不同比例的SA/HNTs墨水的剪切變稀和剪切屈服特性。結(jié)果表明，SA/HNTs墨水隨著SA的濃度從低到高(4-8%)，同樣表現(xiàn)出典型的剪切變稀和剪切屈服特性。在圖1c中，在剪切速率0.1 s^-1時，隨著SA濃度從4%增加到8%，墨水粘度從823.7 Pa·s增加到3410.4 Pa·s；在圖1d中，當剪切應力1 Pa時，隨著SA濃度從4%增加到8%，G’從586.5 Pa增加到2976.4 Pa，這表明隨SA含量增加，SA與HNTs形成了更強的相互作用網(wǎng)絡結(jié)構。另外，當剪切速率從0.1 s^-1增加到103 s^-1，剪切應力從1 Pa增加至10³ Pa時，SA/HNTs墨水所有比例的粘度急劇下降幾個數(shù)量級，這說明在剪切速率和剪切應力增加時SA/HNTs墨水都表現(xiàn)出剪切稀化和剪切屈服特性。此外，對SA/HNTs的粘彈性也進行了測試。如圖1e，在振蕩頻率掃描測試中，當SA的濃度從4%增加到8%時，SA/HNTs墨水的G’和G’’都明顯增加，不過SA/HNTs墨水都仍具有類固體性質(zhì)(G’>G’’)。因此，結(jié)合材料的粘彈性、剪切變稀和剪切屈服特性，選擇7:35的SA/HNTs墨水作為3D打印模型的濃度。

  為了進一步驗證7:35的SA/HNTs墨水的打印性能，同樣測試了墨水的循環(huán)應變時間掃描(圖1f)。當受到高(200%)至低(1%)應變循環(huán)處理時，墨水表現(xiàn)出“液-固”轉(zhuǎn)變性質(zhì)。在低應變時，SA/HNTs墨水表現(xiàn)出類固體性質(zhì)；當高應變時，墨水表現(xiàn)為類液體性質(zhì)，這對SA/HNTs作為3D打印墨水是十分有利的。此外，該墨水在50℃以下不影響墨水流變狀態(tài)。

圖1 SA/HNTs支架的制備及SA/HNTs墨水的流變性能。SA/HNT陶瓷支架的制備示意圖(a)；SA/HNT油墨的流變試驗,不同SA濃度下SA/HNT油墨的圖像(b)；不同SA濃度下油墨的表觀粘度隨剪切速率的函數(shù)(c)， G ''隨剪切應力的函數(shù)(d)， G ''和G "隨振蕩頻率掃描的函數(shù)(e)；7:35 SA/HNT油墨的循環(huán)階躍應變掃描測量(f)

  通過流變測試發(fā)現(xiàn)，隨著SA的濃度提升，SA/HNTs墨水的粘度逐漸提升。為了研究SA與HNTs之間的相互作用力，對SA/HNTs墨水進行了Zeta電位、XRD、紅外以及XPS表征。圖2a是HNTs和SA/HNTs的Zeta電位圖。結(jié)果表明，當SA逐漸加入至HNTs后，相比于HNTs，整個復合體系的電性先是平穩(wěn)后再負電性增加。這是因為SA呈負電性，由于靜電引力中和了HNTs內(nèi)表面的部分電荷。除了靜電引力外，還有氫鍵作用，圖2b是SA、HNTs與SA/HNTs的紅外光譜圖。SA的C=O伸縮振動和HNTs的Al-OH伸縮振動分別從1594 cm^-1和3692 cm^-1移動到1616 cm^-1和3699 cm^-1。HNTs的Si-O-Si伸縮振動也從1005 cm^-1移動到1014 cm^-1。這可能是由于SA與HNTs之間形成了氫鍵(O-H…O)。因為SA含有豐富的含氧極性基團(-OH、-COO-、C-O-C)，可以與HNTs表面的Al-OH和Si-O-Si產(chǎn)生氫鍵相互作用。圖2c是SA、HNTs與SA/HNTs的XRD圖。HNTs的衍射峰出現(xiàn)在12.3^o、20.1^o和25^o，分別對應于HNTs的(001)、(020、110)、和(020)晶面。由于其無定形結(jié)構，純SA沒有明顯的峰。通過比較，SA/HNTs保留了HNTs的晶體結(jié)構。

  為研究材料表面的相互作用，對SA/HNTs和HNTs進行XPS光譜掃描(圖2d和圖2g)。HNTs的特征能譜峰出現(xiàn)在103.1 eV和74.1 eV處，分別對應的是Si2p和Al2p電子軌道。在SA/HNTs的譜圖中，也同樣存在Si2p和Al2p電子軌道的特征峰，并且SA/HNTs光譜中的1068.1 eV處新出現(xiàn)的Na1s峰，表明SA成功摻入HNTs中。隨后再對SA/HNTs和HNTs的精細譜Si2p和Al2p進行分析。如圖2e和圖2h，HNTs的Si2p光譜在103.01 eV 和103.52 eV存在兩個峰，分別歸屬于Si-OH和Si-O鍵，而在加入SA之后，SA/HNTs的Si2p光譜的Si-OH和Si-O鍵的結(jié)合能增大，分別位于103.15 eV和103.68 eV。同樣，如圖2f和圖2i，Al2p的兩個峰在75.08 eV(Al-OH)和74.58 eV(Al-O)也分別移動到75.33 eV和74.83 eV，表明當加入SA后，由于氫鍵相互作用，Si-OH、Si-O鍵和Al-OH、Al-O鍵周圍環(huán)境發(fā)生了變化。

  圖2j形象說明了SA和HNTs存在的界面作用，SA溶液帶負電，會與HNTs帶正電的管內(nèi)腔表面發(fā)生靜電引力作用。另外，由于SA分子鏈中含有豐富的含氧極性基團(-OH、-COO-、C-O-C)，極易與HNTs形成氫鍵。正因為靜電引力和氫鍵作用的存在，使SA與HNTs存在很強的界面作用，從而使SA/HNTs墨水具有可打印性和能保持一定的形狀。

圖2 SA與HNTs的相互作用。HNTs和SA/HNTs的Zeta電位(a)；SA、HNTs和SA/HNTs的FTIR光譜(b)和XRD譜圖(c)；HNTs (d)、SA/HNTs (g)的XPS譜圖及其對應的高分辨率XPS Si2p譜圖(e和h)和XPS Al2p譜圖(f和i)；HNTs與SA相互作用示意圖(j)

  為了使打印出來的模型強度更高，利用鈣離子溶液使SA/HNTs墨水交聯(lián)成SA/HNTs水凝膠，從而增強其機械性能。如圖3a，用鈣離子交聯(lián)后得到的7:35 SA/HNTs水凝膠的抗壓強度達1165.9 KPa，所能承受的應變?yōu)?4.8%。而單組分7 wt%的SA水凝膠的抗壓強度只有97.8 KPa，所能承受的應變僅為49.2%。SA/HNTs水凝膠相比于SA水凝膠具有更高的壓縮強度和壓縮應變。此外，通過循環(huán)壓縮測試進一步驗證SA/HNTs水凝膠的壓縮性能(圖3b-d)，結(jié)果表明，SA/HNTs水凝膠具有更高的彈性。在循環(huán)壓縮時，壓縮應變不斷增加(10-60%)，SA/HNTs水凝膠在循環(huán)的過程中沒有被破壞，在整個循環(huán)壓縮過程具有很好的形變能力，而SA水凝膠在循環(huán)進行至50%的應變時，循環(huán)的應力應變曲線出現(xiàn)折點，這說明SA水凝膠被破壞，形變彈性能力不及SA/HNTs水凝膠。另外，將SA/HNTs水凝膠制成一維的細絲進行拉伸測試，通過實驗發(fā)現(xiàn)細絲能夠承受200 g的重物且其拉伸強度達394.0 KPa(圖3e-f)。而SA水凝膠，因為其較弱的機械性能，無法進行拉伸性能測試。SA/HNTs水凝膠機械性能較好的原因可能有三個：(1) SA溶液與鈣離子相遇時，SA分子的G單體就會與鈣離子螯合，形成穩(wěn)定的“蛋-盒模型”；(2) HNTs與SA混合后，HNTs和SA的靜電作用和氫鍵作用；(3)帶負電的HNTs和帶正電鈣離子存在靜電作用，從而促進SA和鈣離子交聯(lián)。正是這三個原因，使得SA/HNTs水凝膠具有相應的抗壓強度和拉伸強度，這十分有利于3D打印模型的成型。

  接著用SEM對3D打印的支架模型進行了觀察。對于3D模型，所有的復雜的結(jié)構均是由針孔擠出的一條條細絲逐層打印而成，因此首先對3D打印細絲進行了SEM測試(圖3g)。凝膠表面分布著大量的HNTs，而SA則像“膠水”一樣將HNTs纏結(jié)在一起。有趣的是，打印出來的3D模型中埃洛石表現(xiàn)出取向排列特性。圖3h是網(wǎng)格狀SA/HNTs水凝膠的SEM俯視圖，可知HNTs和SA的分布情況與上述細絲一樣，表明在打印的過程中，逐層打印并不會破壞其表面的形態(tài)。通過對其表面進行元素掃描，表面的C、O、Al、Si和Na元素的均勻分布，說明HNTs和SA充分均勻的混合和分散。圖3i是SA/HNTs水凝膠的SEM截面圖，從截面的形態(tài)看，HNTs在其內(nèi)部交叉分布，SA在HNTs之間均勻分布，HNTs管之間形成類三角的結(jié)構，支撐著整個結(jié)構，這可能是SA/HNTs相比于它們的單組分具有較強的流變性能、機械性能和可打印性的一個原因。

圖3 SA/HNT水凝膠的力學性能和掃描電鏡。水凝膠的壓縮應力-應變曲線(a)；不同壓縮循環(huán)下，7 wt% SA (c)和SA/HNT水凝膠(d)的壓縮特性 (b) 和壓縮應力-應變曲線。在SA/HNTs水凝膠的細絲(直徑為2mm)上懸掛200 g的重量(e)；紗線細絲的拉伸應力-應變曲線(f)；SA/HNTs水凝膠的細絲(直徑為0.26 mm)的SEM照片(g)；水凝膠在不同放大倍數(shù)下的SEM圖像(俯視圖)及其元素分布圖 (h)以及剖面圖(i)

  借助CAD軟件設計模型，通過3D打印機的實際測試，7:35的SA/HNTs墨水能夠逐層打印出具有各種幾何形狀的3D模型且具有良好的成型性，例如五角星、JNU字母、鼻子和耳朵模型(圖4a)。為了進一步證明SA/HNTs水凝膠的打印保真度，通過打印傾斜角度為45^o和60^o的梯形模型對其形狀保真度進行驗證。如圖4b所示，梯形的預設長度和角度與最終打印出來的值相比，實驗值僅略低于理論值。值得注意的是，所打印的長方條和五角星由于其良好的柔韌性可以抵抗大的彎曲和扭曲變形。基于上述結(jié)果，SA/HNTs墨水可作為具有高形狀保真度和良好柔韌性的優(yōu)良打印材料。為了驗證SA/HNTs水凝膠的燒結(jié)前后的收縮情況，將已確定尺寸的3D打印的圓柱形SA/HNTs水凝膠置于馬弗爐，等待燒結(jié)程序結(jié)束后，比較其燒結(jié)前后高度和直徑的變化。其燒結(jié)前圓柱形SA/HNTs水凝膠的高度和直徑的實驗值分別為11.9 mm和7.9 mm，而當燒結(jié)后這兩個數(shù)值分別變?yōu)?.8 mm和5.1 mm，高度和直徑的收縮率約為65%。后續(xù)將通過收縮比例設計模型，在高溫燒結(jié)后即可得到了理想尺寸的模型(圖4c)。

  圖4d和圖4e是不同放大倍數(shù)下，SA/HNTs陶瓷支架的SEM照片及其C、O、Al、Si和Na元素圖像以及支架斷面的SEM圖。通過與圖3g和圖3h對比，SA/HNTs表面的HNTs結(jié)構已被高溫破壞，但是仍可以觀察到HNTs取向的存在，且表面的元素仍均勻分布。另外，在斷面圖中，HNTs仍然是交叉分布，相較于表面的HNTs管狀結(jié)構，內(nèi)部的HNTs管狀結(jié)構保持得更好，這是由于外部的HNTs對內(nèi)部形成了一個保護作用。此外，因為高燒燒結(jié)使聚合物降解的緣故，可以看到SA/HNTs陶瓷支架中SA的已被完全碳化。

圖4 SA/HNT支架的3D打印與燒結(jié)。代表圖像的印刷五點恒星,JNU信件,鼻子模型,和耳朵模型(a);實驗和理論的比較值的長度,寬度,高度,和梯形角結(jié)構斜坡的45°和60°(b);SA / HNT水凝膠的網(wǎng)格和牙齒結(jié)構燒結(jié)前后外觀(c);SA / HNTs陶瓷支架表面的SEM圖像（d）、元素Mapping圖(d)，支架斷面視圖(e)

  通過在SA/HNTs陶瓷支架上培養(yǎng)BMSCs以驗證SA/HNTs陶瓷支架的生物相容性。圖5a是用CCK-8檢測試劑盒檢測細胞活力得到的細胞活力圖，無論是培養(yǎng)24 h還是48 h，SA/HNTs陶瓷支架細胞活力均超過80.0%，符合生物安全要求。如圖5b是在SA/HNTs陶瓷支架上培養(yǎng)BMSCs 24和48 h后用Calcein-AM/PI試劑盒染色的熒光圖像。從熒光圖像可以看到將細胞在支架上培養(yǎng)24和48 h后，SA/HNTs陶瓷支架的表面上觀察到了大量活細胞。另外，48 h與24 h相比活細胞數(shù)量都大大增多，表明SA/HNTs陶瓷支架細胞相容性好。如圖5c中，用LSCM觀察了BMSCs在SA/HNTs陶瓷支架上的鋪展行為。在支架上培養(yǎng)24 h后，支架上的細胞觀察到了少量偽足，且細胞鋪展面積較小，表明此時細胞已經(jīng)開始鋪展。細胞培養(yǎng)48 h后，發(fā)現(xiàn)在支架上的細胞的偽足均顯著增多，且細胞鋪展面積也顯著增大。類似地，用SEM觀察BMSCs在SA/HNTs陶瓷支架上的鋪展行為也得到同樣的結(jié)果(圖5d)。LSCM和SEM圖像說明了細胞在48 h后已經(jīng)開始在支架上鋪展，支架并不會影響細胞的生長甚至細胞能夠在其表面很好地生長。SA/HNTs陶瓷支架克服了原來細胞在SA水凝膠表面難以黏附的缺點，原因可能是HNTs的加入以及燒結(jié)使支架表面的粗糙度增加，從而提高了細胞的附著力。

  采用ALP活性和鈣沉積分析SA/HNTs陶瓷支架上的細胞成骨分化能力，圖5e分別是BMSCs在支架上培養(yǎng)7和14天的ALP結(jié)果。培養(yǎng)7天后，發(fā)現(xiàn)支架表面的ALP有少量褐色沉積，當培養(yǎng)時間延長至14天時，支架上的褐色沉淀數(shù)量增多，表明ALP活性在逐漸增強；圖5f是BMSCs在支架上培養(yǎng)14和21天的鈣沉積的結(jié)果。培養(yǎng)14天后，用茜素紅染色發(fā)現(xiàn)支架表面觀察到紅色礦化沉積。當培養(yǎng)時間延長至21天時，細胞數(shù)量增多并在支架空隙間已連成一片膜，支架上有大量的紅色礦化沉積物生成，存在較多的鈣沉積簇。鈣沉積的定量分析結(jié)果直觀的反映了隨著時間的增加，支架上細胞的鈣沉積能力的增強。如圖5g-j PCR結(jié)果所示，在SA/HNTs陶瓷支架上培養(yǎng)7和14天Runx2、OPN、COL-I和OCN基因的相對表達量與對照組相比均顯著增加。培養(yǎng)14天的基因相對表達的量與培養(yǎng)7天相比也明顯增加且具有顯著性差異。SA/HNTs陶瓷支架對BMSCs具有很好的成骨活性，使其在骨缺損修復應用上具有很大的潛力。

圖5 SA/HNT陶瓷支架的生物相容性研究SA/HNT陶瓷支架上培養(yǎng)24和48小時的骨髓間充質(zhì)干細胞細胞活力(a)、熒光染色圖像(b)、LSCM圖像(c)和SEM圖像(d);SA/HNT陶瓷支架上培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細胞的ALP (e)和茜素紅(f)染色。SA/HNT陶瓷支架培養(yǎng)7、14 d時，Runx2 (g)、OPN (h)、CoL-I (i)、OCN (j)的相對基因表達量(*P< 0.05，**P< 0.01)

  為了驗證SA/HNTs陶瓷支架體內(nèi)骨缺損的修復能力，將陶瓷支架植入大鼠顱骨缺損處，圖6a是大鼠顱骨修復的對照組和植入SA/HNTs陶瓷支架組植入圖。6和12周后，通過Micro-CT評估SA/HNTs陶瓷支架在體內(nèi)骨缺損的修復能力，結(jié)果表明在手術后空白組和支架組均有新骨生成，其中支架組新生骨生成面積大于空白組(圖6b)。大鼠顱骨缺損部位的骨密度(BMD)和BV/TV的定量分析結(jié)果也證明了支架組新生骨優(yōu)于對照組(圖6c)。將SA/HNTs陶瓷支架植入6和12周后，通過HE和Masson染色在骨-植入物界面處評估新骨形成情況。HE染色情況如圖6d所示，在第6周，與對照組相比，SA/HNTs陶瓷支架組有更厚的基質(zhì)生成，有較多的新生血管和新生骨出現(xiàn)，而對照組顱骨缺損部位只有少量的組織纖維填充，僅有少量的新生骨和血管生成。在第12周，SA/HNTs陶瓷支架組在缺損處與對照組比有更多的新骨形成。Masson染色與HE染色結(jié)論一致(圖6e)，在第6周，對照組顱骨缺損處僅有少量的藍色的膠原纖維填充，無明顯新生骨形成，而SA/HNTs陶瓷支架組顱骨缺損處被大量藍色的膠原纖維填充，沉積的膠原纖維層較厚，排列更加致密，有較多的新生血管和新生骨生成。在第12周，與對照組比，SA/HNTs陶瓷支架組在缺損處同樣地有更多的新骨形成。為了進一步驗證SA/HNTs陶瓷支架的促成骨效果，利用免疫組織化學染色觀察手術6和12周后大鼠顱骨中的Runx2、OCN和ALP三種蛋白的表達情況。由圖6f可知，對照組在顱骨缺損部位的細胞僅有少量Runx2、OCN和ALP的陽性表達。而對于SA/HNTs陶瓷支架組顱骨缺損部位周圍可見更多的陽性表達，表明SA/HNTs陶瓷支架組能促進顱骨損傷部位細胞表達Runx2、OCN和ALP，從而促進顱骨缺損的修復。

圖6 SA/HNT陶瓷支架的體內(nèi)骨再生能力。支架植入手術圖(a);植入后6周和12周顱骨缺損的Micro-CT三維重建圖像(紅色點圈為初始缺損區(qū)域)(b);術后6周和12周各組骨密度、BV/TV(c)、H&E (d)和馬松三色(e)染色定量統(tǒng)計。各組Runx2、OCN、ALP免疫組化染色圖(f) (*P <0.05，**P <0.01);圓圈表示新形成的血管，三角形表示新形成的骨骼

  本研究通過將SA和HNTs在水溶液中混合得到SA/HNTs打印墨水，并利用3D打印技術和高溫燒結(jié)技術制備出用于骨缺損修復的高性能復合陶瓷支架。SA和HNTs之間的氫鍵和靜電吸引使SA/HNTs油墨具有優(yōu)異的可打印性和形狀保真度。墨水在CaCl₂溶液中交聯(lián)后得到具有良好抗壓和抗拉強度的SA/HNTs水凝膠。利用3D打印技術獲得不同形狀的水凝膠支架，并通過高溫燒結(jié)制備高強度陶瓷支架。對SA/HNT陶瓷支架的細胞相容性和成骨活性進行評價，結(jié)果表明該支架具有良好的生物相容性和成骨活性。大鼠顱骨修復實驗表明，SA/HNTs陶瓷支架在體內(nèi)也具有良好的成骨作用。SA/HNTs陶瓷支架具有綜合性能優(yōu)異、原料來源豐富、可設計性高等優(yōu)點，在牙齒修復、髖關節(jié)、骨科植入物等缺陷修復方面具有重要的應用前景。

  該論文得到了國家自然科學基金（52073121,32071326）、廣東省自然科學基金（2021A1515011196, 2023A1515011091）、中央高�；究蒲袑ｍ椯Y金（21622406）、佛山國家高區(qū)產(chǎn)業(yè)化創(chuàng)業(yè)團隊計劃（2220197000129）、廣東醫(yī)科大學附屬醫(yī)院“臨床醫(yī)學+”項目（CLP2021A001）等項目的資助。

  論文鏈接：https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0266353824001076