華東理工劉潤(rùn)輝教授課題組 Nat. Microbiol.：細(xì)胞膜和DNA雙靶點(diǎn)抗耐藥真菌

2024-04-08 來源：中國(guó)聚合物網(wǎng)

耐藥真菌嚴(yán)重威脅人類生命健康，傳統(tǒng)的單靶點(diǎn)抗真菌藥物難以應(yīng)對(duì)耐藥真菌的迅速發(fā)展。雙靶點(diǎn)藥物有望通過作用于微生物的多個(gè)途徑顯著降低真菌耐藥發(fā)生，在藥物研究中具有很大前景。因此，設(shè)計(jì)和發(fā)現(xiàn)雙靶點(diǎn)抗耐藥真菌新分子對(duì)耐藥真菌感染治療和應(yīng)對(duì)真菌耐藥性挑戰(zhàn)具有重要意義。然而，發(fā)現(xiàn)具有高活性、高選擇性的雙靶點(diǎn)抗耐藥真菌活性分子是本領(lǐng)域重大挑戰(zhàn)，一直未取得突破。

近期，劉潤(rùn)輝教授課題組首次設(shè)計(jì)并發(fā)現(xiàn)了具有高活性和高選擇性的雙靶點(diǎn)高效抗耐藥真菌新分子，解析了新分子通過真菌細(xì)胞膜和DNA雙靶點(diǎn)抗耐藥真菌新機(jī)制，提出了雙靶點(diǎn)抗耐藥真菌活性分子的設(shè)計(jì)策略，為抗耐藥真菌藥物新機(jī)制研究和應(yīng)對(duì)抗真菌耐藥性挑戰(zhàn)提供了新思路。該成果以“A dual-targeting antifungal is effective against multi-drug resistant human fungal pathogens”發(fā)表在Nature Microbiology (Nat. Microbiol, 2024, DOI: 10.1038/s41564-024-01662-5)。

臨床抗真菌藥物數(shù)量有限且往往伴隨著嚴(yán)重的毒副作用，導(dǎo)致真菌感染對(duì)人類健康構(gòu)成重大威脅，真菌耐藥性的迅速出現(xiàn)和傳播加劇了這一現(xiàn)狀。雙靶點(diǎn)藥物可同時(shí)作用于微生物的多個(gè)途徑，可有效減緩耐藥性的產(chǎn)生，在藥物研究中具有很大前景。盡管臨床中通過兩種藥物聯(lián)用的替代方案實(shí)現(xiàn)雙靶點(diǎn)抗耐藥真菌，但兩種藥物在體內(nèi)的分布和藥代動(dòng)力學(xué)各不相同，使得治療效果受到限制。真菌和哺乳動(dòng)物細(xì)胞同作為真核細(xì)胞結(jié)構(gòu)高度相似，導(dǎo)致抗真菌靶點(diǎn)有限，即使發(fā)現(xiàn)單一靶點(diǎn)的選擇性抗真菌分子也極其困難。因此，雙靶點(diǎn)藥物在抗真菌研究領(lǐng)域一直未取得突破。

劉潤(rùn)輝教授課題組在前期研究中，提出了以優(yōu)異生物安全性的聚噁唑啉（多肽主鏈上酰胺鍵轉(zhuǎn)移至側(cè)鏈）模擬天然多肽，創(chuàng)新性地實(shí)現(xiàn)了基于聚噁唑啉骨架的功能性多肽模擬，發(fā)現(xiàn)了體內(nèi)外高效抗耐藥細(xì)菌和耐藥真菌的聚噁唑啉活性分子（Angew. Chem. Int. Ed. 2020, 59, 6412，VIP論文，ESI高被引；Angew. Chem. Int. Ed. 2022, 61, e202200778，VIP論文；J. Am. Chem. Soc. 2023, 145, 25753，JACS Spotlight）。本研究中進(jìn)一步提出通過正電荷和兩親性的聚噁唑啉模擬宿主防御肽同時(shí)引入DNA結(jié)合基團(tuán)作為疏水性結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)策略，通過調(diào)控正電荷和DNA結(jié)合基團(tuán)的比例成功獲得了高活性、高選擇性雙靶點(diǎn)抗耐藥真菌新分子。雙靶點(diǎn)活性分子對(duì)多種臨床常見耐藥真菌（包括念珠菌屬、新生隱球菌、格特隱球菌和煙曲霉菌）具有高活性和高選擇性，在角膜炎、擦傷、系統(tǒng)感染等多個(gè)小鼠感染模型中展示優(yōu)異治療耐藥真菌感染效果，為抗耐藥真菌藥物設(shè)計(jì)和新機(jī)制研究提供了新思路（圖1）。

圖 1 真菌細(xì)胞膜和DNA雙靶點(diǎn)的HDP模擬聚噁唑啉的設(shè)計(jì)策略與抗耐藥真菌感染性能

本研究首先設(shè)計(jì)可與DNA通過π-π作用結(jié)合的萘基作為聚噁唑啉的疏水基團(tuán)，側(cè)鏈氨基為正電荷基團(tuán)，通過2-噁唑啉單體共聚合成了不同正電荷和DNA結(jié)合基團(tuán)比例的HDP模擬聚噁唑啉分子庫(kù)，并探究了一系列聚噁唑啉的抗耐藥真菌活性和哺乳動(dòng)物細(xì)胞以及血紅細(xì)胞毒性。其中，DNA結(jié)合基團(tuán)比例20%的聚噁唑啉 (Gly_0.8Nap_0.2)₂₀的抗耐藥真菌活性（MIC=0.78–3.13 μg/mL）與抗耐藥真菌藥物兩性霉素B相當(dāng)（MIC=0.78–1.56 μg/mL），對(duì)血紅細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的選擇性（HC₅₀/MIC=1–2, IC₅₀/MIC=1–2）遠(yuǎn)超過兩性霉素B（HC₅₀/MIC=1–2, IC₅₀/MIC=1–2），表明優(yōu)選聚噁唑啉 (Gly_0.8Nap_0.2)₂₀具有出優(yōu)異的抗耐藥真菌活性與抗真菌選擇性（圖2）。

圖 2 HDP模擬聚噁唑啉的合成、表征與體外抗耐藥真菌活性

優(yōu)選HDP模擬聚噁唑啉 (Gly_0.8Nap_0.2)₂₀優(yōu)異的抗耐藥真菌性能促使他們研究其抗真菌機(jī)制。通過共聚焦顯微鏡研究觀察熒光標(biāo)記的聚噁唑啉的動(dòng)態(tài)殺菌過程，發(fā)現(xiàn)(Gly_0.8Nap_0.2)₂₀在加入真菌溶液后立即積聚在真菌表面并逐漸進(jìn)入真菌細(xì)胞質(zhì)。孵育 60 秒后，在真菌細(xì)胞質(zhì)中觀察到大量的(Gly_0.8Nap_0.2)₂₀，但沒有 PI 信號(hào)。72 秒后，在真菌細(xì)胞質(zhì)中觀察到紅色熒光 PI 信號(hào)，表明真菌被殺死。值得注意的是，(Gly_0.8Nap_0.2)₂₀與真菌共孵育后，真菌的 ζ 電位從?5.3 mV 變?yōu)?/span>+11.9 mV。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn) (Gly_0.8Nap_0.2)₂₀顯示出可忽略的真菌細(xì)胞壁擾動(dòng)和明顯的真菌質(zhì)膜去極化。此外，添加帶有負(fù)電荷的外源真菌膜脂質(zhì)成分磷脂酰肌醇和磷脂酰甘油后 (Gly_0.8Nap_0.2)₂₀的抗真菌活性被顯著抑制，通過掃描電子顯微鏡（SEM）觀察到 (Gly_0.8Nap_0.2)₂₀處理后的白色念珠菌 K1細(xì)胞膜出現(xiàn)明顯受損。以上研究表明了細(xì)胞膜作為 (Gly_0.8Nap_0.2)₂₀的一個(gè)抗真菌作用靶點(diǎn)（圖3）。

圖 3 雙靶點(diǎn)聚噁唑啉 (Gly_0.8Nap_0.2)₂₀的真菌膜作用靶點(diǎn)研究

進(jìn)一步通過共聚焦顯微鏡觀察在DNA結(jié)合染料DPAI （結(jié)合后為藍(lán)色熒光）存在下 (Gly_0.8Nap_0.2)₂₀對(duì)白色念珠菌 K1 的殺菌過程，他們發(fā)現(xiàn) (Gly_0.8Nap_0.2)₂₀在真菌細(xì)胞質(zhì)中不斷富集隨后逐漸進(jìn)入真菌細(xì)胞核，在進(jìn)入整個(gè)真菌細(xì)胞核超過 30 秒后，真菌細(xì)胞質(zhì)中突然出現(xiàn)紅色熒光 PI 信號(hào)，表明真菌被殺死。隨后，真菌DNA-DAPI 結(jié)合產(chǎn)生的藍(lán)色熒光逐漸消退，意味著與DNA結(jié)合的DPAI可能被 (Gly_0.8Nap_0.2)₂₀取代。他們從真菌中提取出DNA 并將其與 (Gly_0.8Nap_0.2)₂₀的共孵育，發(fā)現(xiàn)DNA粒徑從 47nm 增大 154nm；進(jìn)一步研究 (Gly_0.8Nap_0.2)₂₀對(duì) 不同的DNA 結(jié)合染料的競(jìng)爭(zhēng)性置換實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn) (Gly_0.8Nap_0.2)₂₀對(duì)DAPI（一種代表性的 DNA 小凹槽結(jié)合染料）和EB（一種代表性的DNA嵌入染料）都顯示顯著的熒光猝滅效果。同時(shí)，在真菌 DNA 中加入 (Gly_0.8Nap_0.2)₂₀后的紫外、圓二色譜和ζ 電位測(cè)試結(jié)果也表明 (Gly_0.8Nap_0.2)₂₀對(duì)DNA的結(jié)合。在抗菌測(cè)試中添加外源的DNA，(Gly_0.8Nap_0.2)₂₀的抗真菌活性被顯著抑制。這些結(jié)果共同表明了(Gly_0.8Nap_0.2)₂₀通過作用于真菌細(xì)胞膜和DNA雙靶點(diǎn)殺菌機(jī)制（圖4）。

圖 4 雙靶點(diǎn)聚噁唑啉 (Gly_0.8Nap_0.2)₂₀的真菌DNA作用靶點(diǎn)研究

在小鼠角膜炎和皮膚擦傷感染模型感染中，雙靶點(diǎn)聚噁唑啉 (Gly_0.8Nap_0.2)₂₀均顯示了與臨床抗真菌藥物相當(dāng)?shù)哪退幷婢腥局委熜Ч?/span>(Gly_0.8Nap_0.2)₂₀顯著降低了感染部位的菌落負(fù)荷，減少了菌絲入侵的嚴(yán)重程度，并且未發(fā)現(xiàn)明顯毒性，展示了突出的耐藥真菌局部感染治療潛力（圖5）。

圖 5 雙靶點(diǎn)聚噁唑啉 (Gly_0.8Nap_0.2)₂₀有效治療耐藥真菌角膜炎和皮膚擦傷感染

在白色念珠菌誘導(dǎo)的小鼠系統(tǒng)感染模型中，雙靶點(diǎn)聚噁唑啉 (Gly_0.8Nap_0.2)₂₀有效救治感染小鼠，并提高感染小鼠的存活率，存活率與臨床抗真菌藥物兩性霉素B相當(dāng)。并且 (Gly_0.8Nap_0.2)₂₀能夠清除小鼠多個(gè)器官中的真菌，降低真菌負(fù)荷，阻止真菌對(duì)心、腎等器官的入侵。此外，處理后小鼠的組織學(xué)分析和血液生化指標(biāo)結(jié)果顯示 (Gly_0.8Nap_0.2)₂₀具有優(yōu)異的體內(nèi)生物相容性和安全性，表明(Gly_0.8Nap_0.2)₂₀具有優(yōu)異的耐藥真菌系統(tǒng)感染治療潛力（圖6）。

圖 6 雙靶點(diǎn)聚噁唑啉 (Gly_0.8Nap_0.2)₂₀有效治療耐藥真菌系統(tǒng)感染

華東理工大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院副研究員周敏、博士研究生劉龍強(qiáng)是論文的第一作者，劉潤(rùn)輝教授為通訊作者。該成果得到了國(guó)家自然科學(xué)基金委杰出青年科學(xué)基金、科技部重點(diǎn)研發(fā)項(xiàng)目等基金的資助。

論文鏈接: https://www.nature.com/articles/s41564-024-01662-5

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（責(zé)任編輯：xu）

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